THE EFFECT OF ZINC AND RARE EARTH ELEMENTS ON METALLOTHIONEIN OF BIVALVE MOLLUSC RECONSTITUTED IN VITRO

Abstract

Rare earth elements (REEs) are increasingly attracting attention as new pollutants due to their growing use in various industries, leading to environmental contamination. Metallothioneins (MT) are low molecular weight proteins rich in cysteine that are capable of binding d-metals, both essential and toxic. Since the REEs exhibit the ionic mimicry with the essential metals, their ability to bind to MT can be expected. However, data on the utilizing of MT as a molecular targets of REEs, in particular gadolinium (Gd3+) and yttrium (Y3+) are currently lacking. Bivalve molluscs belong to the main filtered organisms in the freshwater bodies, and, consequently, they can accumulate the REEs in their tissues. Therefore, the aim of this study was to compare the ability of MT to reconstruct their native structure with the essential metal Zn2+ and representative REEs Gd3+ and Y3+ utilizing the UV-spectral peculiarities of MT. To do this, MT was isolated from the digestive gland of bivalve mollusc Unio tumidus using gel permeable chromatography and subjected to demetalation by 0.05 M HCl. Resulted partially metallated metallothionein (pMT) was subjected to chromatography again and incubated with Zn²⁺, Gd³⁺ and Y³⁺ ions for 60 min with the aim to reconstitute the metallothionein during 1 h (MTr 1 h) and 24 h (MTr 24 h). MTr was exposed to H2O2 in two concentrations (0.5 mM and 5 mM) for 1 h to assess the stability of thiolate clusters. For all utilized forms (MT, pMT, MTr 1h, MTr 24 h) UV spectra were determined and their indexes of absorption were calculated. The results of the study indicated partial demetallisation of MT in an acidic solution. Incubation with each of the three metals for 1 hour led to a decrease in spectral intensity at 255 nm, with Gd-MTr causing the greatest decrease in spectral intensity in this range. The decrease at 215–220 nm (in the blue shift region) indicated the ability of these metals to influence zinc binding. All types of MTr exhibited virtually identical spectral absorptions across all ranges after 24 hours. Furthermore, over 24 hours, Zn-MTr significantly altered the absorption of MT, which may indicate a redistribution of metals, whereas the absorption for Gd and Y MTr was not changed prominently. Following treatment with 0.5 mM H₂O₂ for 1 hour, Gd-MTr showed an increase of absorption at 255 nm, whilst Zn-MTr showed a strong increase in absorption at 215–220 nm. Y caused a decrease in this area of spectra. Exposure to 5 mM H₂O₂ led to an increase in absorption at 255 nm in Zn-MTr and Gd-MTr. Particularly, Y-MTr exhibited the greatest decrease in spectral absorption in these ranges, indicating the susceptibility of Y-MTr to oxidation, whilst Gd-MTr exhibited the highest spectral peak at 255 nm. Summarising, basing on the spectral features, we confirmed the ability of Gd and Y to reconstruct the metal-thiolate clusters similar to Zn-thiolate clusters, typical for Zn-MT. The reconstituted Gd-MTr were more stable for the oxidation than Y-MTr.

Рідкісноземельні елементи (РЗЕ) привертають дедалі більше уваги як нові забруднювачі навколишнього середовища у зв’язку з розширенням сфер їх використання та зростанням рівня забруднення екосистем. Металотіонеїни (МТ) є низькомолекулярними протеїнами, багатими на цистеїн, які здатні зв’язувати як есенціальні, так і токсичні d-метали. Оскільки РЗЕ характеризуються явищем іонної мімікрії щодо есенціальних металів, можна припустити їхню здатність взаємодіяти з МТ. Водночас дані щодо взаємодії металотіонеїнів із гадолінієм (Gd³⁺) та ітрієм (Y³⁺) наразі відсутні. Двостулкові молюски є основними організмами-фільтраторами прісноводних водойм, тому здатні накопичувати РЗЕ у своїх тканинах. Відтак метою роботи було порівняти здатність МТ відновлювати нативну структуру за участю есенціального металу цинку та представників РЗЕ – гадолінію й ітрію – на основі аналізу ультрафіолетових спектральних характеристик МТ. Металотіонеїн виділяли з травної залози двостулкового молюска Unio tumidus методом гель-проникної хроматографії та піддавали деметалізації у 0,05 М HCl. Отриманий частково деметалізований металотіонеїн (pMT) повторно очищували та інкубували з іонами Zn²⁺, Gd³⁺ і Y³⁺ протягом 60 хв для реконституції металотіонеїну через 1 год (MTr 1 h) та 24 год (MTr 24 h). Для оцінки стабільності тіолатних кластерів реконструйовані форми обробляли H₂O₂ у концентраціях 0,5 і 5 мМ протягом 1 год. Для всіх досліджуваних форм визначали УФ-спектри та розраховували спектральні індекси поглинання. Встановлено, що кислотна обробка спричиняла часткову деметалізацію МТ. Інкубація з кожним із металів протягом 1 год супроводжувалася зниженням інтенсивності поглинання при 255 нм, причому найбільш виражений ефект спостерігався для Gd-MTr. Зменшення поглинання в діапазоні 215–220 нм свідчило про здатність досліджуваних металів впливати на зв’язування цинку. Через 24 год усі варіанти MTr характеризувалися подібними спектральними показниками. Водночас для Zn-MTr відзначено суттєві зміни поглинання, що може свідчити про перерозподіл металів, тоді як для Gd-MTr і Y-MTr такі зміни були менш вираженими. Після дії 0,5 мМ H₂O₂ для Gd-MTr спостерігалося збільшення поглинання при 255 нм, тоді як для Zn-MTr – у діапазоні 215–220 нм. Для Y-MTr було характерне зниження поглинання в цій області спектра. Після обробки 5 мМ H₂O₂ для Zn-MTr і Gd-MTr також відзначено збільшення поглинання при 255 нм. Водночас Y-MTr характеризувався найбільшим зниженням спектрального поглинання, що свідчить про його вищу чутливість до окиснення. На підставі спектральних характеристик підтверджено здатність гадолінію та ітрію відновлювати метал тіолатні кластери, подібні до характерних для Zn-MT. Реконструйовані форми металотіонеїну з гадолінієм виявилися більш стійкими до окиснення порівняно з формами, що містили ітрій.